The implication of the ηCTF fragment in Alzheimer's Disease : Study of its expression, localization, and degradation;L'implication du fragment ηCTF dans la Maladie d'Alzheimer : étude de son expression, sa localisation et sa dégradation

The amyloid-β (Aβ) peptides, which accumulate in amyloid plaques, are formed by canonical cleavages of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases.

Under physiological conditions, APP is cleaved by α, and γ-secretases, precluding the production of Aβ.

Recently, the matrix metalloproteinase MT5-MMP, referred to as η-secretase, has been identified as a novel APP cleaving enzyme.

The η-secretase targets the APP protein in its amino-terminal part and produces a soluble fragment, the sAPPη, and a transmembrane fragment, the ηCTF, which can then be a substrate of the α- or β-secretase activity generating the soluble fragments Aηα or Aηβ, respectively.

Although Aηα and Aηβ fragments have recently been described as being able to affect synaptic activity, the pathophysiological function of the ηCTF fragment has not yet been studied.

My PhD project has consisted in studying by different approaches the fate, biology and cellular localization of this fragment and in evaluating its contribution in the pathology associated with Alzheimer's Disease (AD).

Using pharmacological approaches, we first showed that ηCTF undergoes degradation in the autophagic and proteasomal pathways.

We established that ηCTF is a precursor for APP-CTFs (C99 and C83), and we also revealed for the first time that overexpressing ηCTF in fibroblasts lacking APP promotes the secretion of Aηα as well as the production of Aβ peptides, demonstrating that ηCTF operates as a novel genuine precursor of Aβ.

Remarkably, we designed a novel immunological probe referred to as ηCTF-NTer that specifically interacts with the N-terminal part of η-CTF, thus targeting ηCTF, Aηα, Aηβ but not C99, C83 nor Aβ.

Immunostaining experiments, using this novel antibody, in vitro, as well as ex vivo, revealed a major Golgi localization of ηCTF and a lower proportion in endosomes.

Interestingly, and in agreement with this endosomal localization, we demonstrated the presence of ηCTF in exosomes purified from culture medium of SH-SY5Y cells expressing wild-type APP as well as in exosomes obtained from wild type mice expressing ηCTF after intracerebroventricular injection of AAV- ηCTF.

Additionally, ηCTF fragments were found surrounding amyloid plaques by immunostaining performed on brain slices of 20 months old 3xTgAD mice.

Finally, preliminary long-term potentiation (LTP) experiments performed on brain sections from wild-type mice showed impaired synaptic activity in the presence of recombinant Aηα and Aηβ peptides.Aβ is certainly not the only pathological actor in AD, as other APP catabolites may also be involved.

Indeed, independently of Aβ, the C99 fragment has been shown to contribute to the molecular and cellular dysfunctions in AD.

In a review in which I contributed, we proposed that γ-secretase should be considered as a beneficial C99-inactivating enzyme and highlighted how the toxicity of C99 may be one of the reasons why inhibiting γ-secretase failed in clinical trials.Much research is undoubtedly still needed in order to fully understand the implication of ηCTF in AD; however, as a precursor of C99 and of Aβ, ηCTF displays a theoretical toxic potential.

The accumulation of ηCTF, its detection around amyloid plaques, as well as its presence in exosomes, which may be responsible for the spread of neuropathology, may all support its potential contribution to AD pathology.

Conclusively, this demonstrates the complexity of AD, the multifactorial disease with various toxic factors that are still being investigated, which likely explains the challenges in discovering a curative and effective treatment.

; Le peptide amyloïde-β (Aβ), le constituant principal des plaques séniles, est formé suite aux clivages canoniques de la protéine précurseur amyloïde (APP) par β- et γ-sécrétases.

Dans les conditions physiologiques, l'APP est clivée par α-, et γ-sécrétases, limitant ainsi la production d'Aβ.

Récemment, la métalloprotéinase matricielle MT5-MMP, appelée η-secrétase, a été identifiée comme une nouvelle enzyme de clivage de l'APP.

L'η-secrétase clive l'APP dans sa partie amino-terminale et produit un fragment soluble, le sAPPη, et un fragment transmembranaire, l'ηCTF qui est aussi substrat de l'α- ou β-secrétase générant respectivement les fragments solubles Aηα ou Aηβ.

Aηα et Aηβ ont récemment été décrits comme pouvant altérer l'activité synaptique, mais la fonction physiopathologique du fragment ηCTF n'a pas encore été décrite.

Mon projet de thèse a consisté à étudier le catabolisme, la biologie et la localisation cellulaire de l'ηCTF pour évaluer sa contribution dans la pathologie associée à la Maladie d'Alzheimer (MA).

Grâce à des approches pharmacologiques, nous avons montré que l'ηCTF est dégradé par les voies du protéasome et de l'autophagie.

Nous avons aussi établi pour la première fois que l'ηCTF est un précurseur des APP-CTFs (C99 et C83), et du peptide Aβ.

En effet, sa surexpression dans des fibroblastes dépourvus d'APP induit non seulement comme attendu la sécrétion d'Aηα mais aussi la sécrétion du peptide Aβ40, démontrant que l'ηCTF se comporte comme un nouveau précurseur d'Aβ.

De manière importante, nous avons développé un nouvel anticorps nommé ηCTF-NTer qui interagit avec la partie N-terminale de l'ηCTF en ciblant l'ηCTF, l'Aηα, l'Aηβ mais pas le C99, le C83 ni l'Aβ.

Des expériences d'immunomarquage, utilisant cet anticorps, in vitro, ainsi qu'ex vivo, ont révélé une localisation majeure de l'ηCTF dans le Golgi et une proportion plus faible dans les endosomes.

De manière intéressante et en accord avec cette localisation endosomale, nous avons démontré la présence de l'ηCTF dans les exosomes purifiés à partir du milieu de culture de cellules SH-SY5Y exprimant l'APP sauvage ainsi que dans les exosomes obtenus à partir de souris sauvages exprimant l'ηCTF suite à l'injection intracérébroventriculaire de virus exprimant l'ηCTF (AAV- ηCTF).

De plus, un marquage spécifique de l'ηCTF a été détecté autour des plaques séniles par immunomarquage réalisé sur des coupes de cerveau de souris 3xTgAD âgées de 20 mois.

Enfin, des expériences de potentialisation à long terme (LTP) réalisées sur des coupes de cerveau de souris sauvages ont montré une activité synaptique altérée en présence des peptides Aηα et Aηβ.Aβ n'est certainement pas le seul acteur pathologique de la MA, puisque d'autres catabolites de l'APP peuvent également être impliqués.

En effet, indépendamment de l'Aβ, notre équipe a établi que le fragment C99 pouvait contribuer aux dysfonctionnements moléculaires et cellulaires observés dans la MA.

Dans une revue dont je suis co-auteur, nous avons proposé que la γ-secrétase soit considérée comme une enzyme bénéfique inactivant le C99 et avons expliqué comment la toxicité du C99 peut être l'une des raisons pour lesquelles l'inhibition de la γ-secrétase a échoué dans les essais cliniques.De nombreuses recherches sont sans aucun doute encore nécessaires pour comprendre pleinement l'implication de l'ηCTF dans la MA ; cependant, en tant que précurseur du C99 et de l'Aβ, l'ηCTF devrait lui aussi présenter un potentiel neurotoxique.

Ainsi sa détection autour des plaques amyloïdes, ainsi que sa présence dans les exosomes sont autant d'éléments qui peuvent soutenir l'hypothèse selon laquelle l'ηCTF pourrait aussi contribuer au développement de la MA.

En conclusion, ces observations illustrent la complexité de la MA, une maladie multifactorielle dont les différents acteurs toxiques font encore l'objet de recherches intenses et ce qui explique probablement pourquoi à l'heure actuelle aucun traitement efficace n'est disponible.