Developpment of an analytical platform combining a separation of amyloid peptids with a immunoassay detection in droplets for Alzheimer disease diagnosis;Développement d'une plateforme d'analyse couplant la séparation de peptides amyloïdes à une immuno-détection digitale en gouttes pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer

Emerging droplet-based microfluidic platform provide new opportunities to develop complex immunoassay with low sample consumption.

This manuscript is dedicated on the development of an analytical platform for isoelectric focusing of amyloid peptides followed by their detection by immunoassay droplet-based microfluidic platform.

A capillary isoeletric focusing method was developed first and allowed separation and collection of Aβ 1-40, Aβ 2-40 and Aβ 5-40 peptides in individual solutions.

The fractions collected were analyzed off-line by Elisa on magnetic beads in batch-wise.

This immune-detection allows the determination of peptide distribution in the different fractions collected.

Then, we used a droplet-based microfluidic platform for immunoassay on magnetic beads.

This platform was adapted and optimized to quantify standard Aβ 1-40 and Aβ 1-42 peptides.

The next step will rely on the quantification of amyloid peptides on cerebrospinal fluid.

In parallel, a study dedicated on microchip analyses to design a total-analysis-system has been performed.

The final purpose is to integrate on-line three main steps; separation, compartmentalization and immune-detection in droplet.

For this study, THV Dyneon has been chosen since this material was also used for the droplet-based microfluidic platform.

A first study demonstrated for the first time electrokinetic separation, of biomolecules (proteins) and hydrophobic dyes in Dyneon THV chip using two separations modes (CZE and NACE respectively).

This work highlighted the THV Dyneon micro-chip versatility.

We can concluded that this new material is promising for further development dedicated to micro system combining separation and compartmentalization in droplet.

A last work aimed to develop a labeling method for amyloid peptides with a new dye, the Chromeo P540, which is adapted for isoeletric focusing (IEF) analysis.

This dye will allow peptides monitoring during the development of IEF/droplet interface.

; L’émergence de nouvelles technologies basées sur la microfluidique de gouttes offre l’espoir de développer des immuno-essais complexes consommant peu d’échantillon.

Cette thèse est dédiée d’une part au développement d’une plateforme d’analyse qui consiste au fractionnement d’un mélange de peptides amyloïdes par focalisation isoélectrique (IEF) pour ensuite procéder à l’immuno-détection en gouttes des différentes fractions.

Une méthode d’IEF en capillaire a été développée et a permis la séparation des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 ainsi que leur collecte dans des solutions individuelles.

Ces solutions de collectes ont été analysées par Elisa sur particules magnétiques.

L’immuno-essais a permis de déterminer la distribution des peptides dans les différentes collectes.

Ces analyses ont d’abord été réalisées en « batch » où les particules magnétiques sont en suspension dans une solution non-confinée.

Ensuite, un dispositif permettant de réaliser des immuno-essais en gouttes a été utilisé.

Cette plateforme a été adaptée et optimisée pour le dosage des peptides Aβ 1-40 et Aβ 1-42 standard en vue de doser ces peptides dans le LCR et d’étendre l’analyse aux autres peptides (Aβ 2-40 et Aβ 5-40).

D’autre part, une partie de la thèse a été dédiée à un travail sur micro-puce en vue de la conception d’un microsystème d’analyse totale intégrant en ligne les trois étapes majeures (séparation, compartimentalisation, immuno-détection en gouttes) de la plateforme d’analyse recherchée.

Pour cette partie nous avons choisi le THV Dyneon qui a déjà servi au transport de bio-molécules en gouttes.

Une première étude a consisté pour la première fois à réaliser des séparations électrocinétiques de protéines et de fluorophores hydrophobes dans les puces en THV Dyneon en utilisant deux modes de séparation (ECZ et NACE, respectivement).

Ceci a permis de démontrer que ce nouveau matériau constitue un candidat prometteur pour le futur microsystème couplant séparation et compartimentalisation en gouttes.

Une dernière étude a consisté au développement d’une méthode de marquage des peptides amyloïdes par un nouvel agent fluorescent, le Chromeo P540, particulièrement adapté pour des analyses IEF.

Cet agent de marquage permettra de détecter les peptides durant la conception de l’interface de couplage (IEF/gouttes).